Неконкурентное ингибирование ферментов (физиология, биохимия, патология, патофизиология, клиническое значение неконкурентного торможения ферментов)

Введение

Неконкурентное ингибирование , тип аллостерической регуляции, представляет собой специфический тип ингибирования фермента, характеризующийся связыванием ингибитора с аллостерическим участком, что приводит к снижению эффективности фермента. Аллостерический участок - это просто участок, где субстрат связывается. Неконкурентное торможение отличается от других видов торможения, таких как конкурентное, неконкурентоспособное и смешанное торможение.

Механизмы неконкурентного ингибирования ферментов

При неконкурентном ингибировании ингибитор связывается в аллостерическом участке независимо от связывания субстрата; это означает, что ингибитор имеет одинаковое сродство как к ферменту, так и к фермент-субстратному комплексу. Эта активность отличает неконкурентное ингибирование от неконкурентоспособного ингибирования, при котором ингибитор связывается только с комплексом фермент-субстрат. При связывании ингибитора с ферментом или комплексом фермент-субстрат фермент не может образовать свой продукт. Результирующее снижение активности фермента не зависит от концентрации субстрата, поскольку ингибитор не конкурирует с субстратом за связывание активного участка. Неконкурентное торможение снижает максимальную скорость каталитической реакции фермента, оставляя сродство фермента к его субстрату неизменным.

Клеточные основы неконкурентного ингибирования

Ферменты служат катализаторами химических реакций во всех живых организмах. Ферменты и их ингибиторы играют важную роль во всей физиологии человека. Метаболизм - это тщательно подобранный набор реакций, отвечающих метаболическим потребностям организма. Потребность отличается от ткани к ткани, даже от клетки к клетке и может меняться со временем или в связи с изменением условий. Ферменты и их регуляторы дают клеткам точный контроль над этими процессами, чтобы обеспечить удовлетворение метаболических потребностей. Одним из примеров важности неконкурентного торможения является его роль в регуляции метаболизма посредством торможения с обратной связью.

При подавлении обратной связи продукты метаболического пути действуют как ингибиторы ферментов. Например, как аланин, так и АТФ действуют как неконкурентные ингибиторы пируваткиназы, фермента, который катализирует конечную стадию гликолитического пути. Ингибирование пируваткиназы позволяет клеткам прекращать расщепление глюкозы при наличии достаточного количества конечного продукта (АТФ и аланина), предотвращая перепроизводство и потерю клеточной энергии. На первой стадии гликолиза гексокиназа функционирует, фосфорилируя глюкозу с образованием глюкозо-6-фосфата. Глюкоза-6-фосфат является мощным неконкурентным ингибитором гексокиназы, который останавливает процесс, если большое количество глюкозы уже расщеплено в гликолитическом пути. Гликолиз является лишь одним из примеров многочисленных метаболических путей, регулируемых неконкурентным ингибированием.

Механизм неконкурентного ингибирования

Механизм неконкурентного торможения был понят с использованием модели ферментативной кинетики Михаэлиса-Ментена в течение столетия. При неконкурентном торможении ингибитор связывается в аллостерическом участке отдельно от активного участка связывания субстрата. Таким образом, при неконкурентном торможении ингибитор может связывать свой целевой фермент независимо от присутствия связанного субстрата. Поставить иначе: ингибитор имеет одинаковое сродство как к ферменту, так и к фермент-субстратному комплексу. Связывание ингибитора с ферментом или комплексом энзим-субстрат инактивирует фермент, препятствуя выработке его конечного продукта. Инактивация фермента снижает максимальную скорость реакции (Vmax), определяемую как скорость реакции при концентрации субстрата, которая полностью насыщает все активные центры конкретного фермента. Константа Михаэлиса (Km) - это концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину Vmax. Km также можно интерпретировать как обратное измерение сродства фермента к субстрату. При неконкурентном ингибировании сродство фермента к его субстрату (Km) остается неизменным, поскольку активный участок не конкурирует с ингибитором. Увеличение концентрации субстрата для преодоления снижения Vmax, вызванного неконкурентным ингибированием, бесполезно, так как конкуренция за активный участок между ингибитором и субстратом не является проблемой ограничения. Снижение Vmax и неизмененного Km является основным способом дифференциации неконкурентного торможения от конкурентного (без прямого изменения Vmax, увеличение Km) и неконкурентного (снижение Vmax и Km).

До преимущественного использования мощного программного обеспечения, используемого сегодня в кинетике ферментов, данные по ферментативной активности и ингибированию наносились на графики для лучшего понимания результатов. График «Линьювер-Берк» является наиболее частым. Графики линейного течения и Бёрка характеризуются 1 / V (V - скорость), нанесенной на ось Y, и 1 / [S] ([S] - концентрация субстрата) на оси x. После построения точек данных, x-перехват представляет 1 / -Km, в то время как y-перехват представляет 1 / Vmax. При неконкурентном торможении при сравнении графиков до и после торможения наблюдается увеличение y-точки пересечения (рис. 1). Этот график коррелирует с уменьшением Vmax (увеличение на 1 / Vmax), вызванным торможением. X-перехват остается неизменным, так как кажущееся сродство фермента к его субстрату (Km, и, следовательно, 1 / -Km) не изменяется. Изменения (или их отсутствие) в Vmax и Km и их графические изображения на графике Линьювер-Берка являются основным способом отличить неконкурентное торможение от конкурентного и неконкурентоспособного торможения.

Клиническое значение неконкурентного ингибирования

Отравление цианидом

Цианид является быстро действующим, потенциально смертельным веществом при попадании в организм. Чаще всего токсичность цианидов является результатом вдыхания дыма при бытовых пожарах. Токсичность обусловлена прекращением окислительного фосфорилирования (продуцирования АТФ с использованием кислорода). Более конкретно, цианид неконкурентно ингибирует цитохром С-оксидазу, последний фермент в цепи транспорта электронов. Современные методы лечения токсичности цианидов направлены на то, чтобы перехватить цианид до того, как он достигнет фермента или вытеснить его из фермента, а не преодолеть ингибирование самого фермента (возможно, из-за неконкурентного характера ингибирования).

Тяжелые металлы

Тяжелые металлы, например ртуть, кадмий и свинец, могут привести к отравлению человека. Механизмы, включающие неконкурентное ингибирование жизненно важных ферментов, имеют корреляцию со всеми тремя металлами. Хотя неясно, насколько эти специфические торможения способствуют общей токсичности этих металлов, такие исследования требуют дальнейшего изучения.

Хотя последствия неконкурентного торможения при отравлении металлами все еще изучаются, их применение в качестве терапевтических средств не только как противоопухолевых препаратов только начинается. Исследования недавно показали, что медь и ртуть как сильные неконкурентные ингибиторы протеазы легкой цепи при отравлении ботулиническим нейротоксином. Было установлено, что они замедляют летальность, вызванную отравлением ботулиническим нейротоксином у грызунов, благодаря неконкурентному ингибированию ферментов нейротоксина.

Хронические заболевания и феномен неконкурентного ингибирования

Сахарный диабет 2 типа (СД2) является одним из наиболее распространенных хронических заболеваний, поражающих систему здравоохранения с высокой заболеваемостью и смертностью. Огромные затраты времени и средств были потрачены на разработку безопасных и эффективных методов лечения СД2, но лекарства не лишены побочных эффектов и по-разному переносятся индивидуально. Исследования продолжают изучать «менее инвазивные» средства контроля уровня сахара в крови. Было обнаружено, что ингибирование кишечных ферментов, ответственных за расщепление пищевого сахара (таких как альфа-глюкозидаза и альфа-амилаза), эффективно в предотвращении постпрандиальной гипергликемии в диабетической популяции. Трава Роша показала активность в качестве неконкурентного ингибитора альфа-глюкозидазы, объясняя его эффективность как традиционного индийского лечения СД2. Точно так же было обнаружено, что растение, используемое для народной терапии по всей Индонезии при СД2, содержит компонент, который действует как неконкурентный ингибитор альфа-амилазы, эффективно снижая уровень глюкозы в крови у диабетических крыс.

Фармакологические компании также подчеркивают необходимость изучения новых молекулярных мишеней для разработки новых лекарств в лечении сахарного диабета. Повышенная продукция глюкозы с помощью глюконеогенеза является четко определенной проблемой у всех диабетиков 2 типа, но ни один препарат не устраняет этот путь гипергликемии. Фруктоза-1,6-бисфосфатаза является ферментом, регулирующим скорость в глюконеогенезе, и недавние исследования показали, что неконкурентные ингибиторы фермента могут быть полезной терапией при СД2.

Наконец, последствия указывают на неконкурентное ингибирование дисульфирама в ингибировании ферментов про-гепатоцеллюлярной карциномы, бензодиазепинов в ингибировании специфических семейств ферментов CYP450, и в качестве потенциального механизма блокирования нейраминидазы при лечении птичьего гриппа. Краткий поиск в PubMed покажет тысячи результатов, которые показывают значение использования неконкурентного торможения в понимании болезней, лекарственной терапии и исследованиях по борьбе с раком.

Литература по неконкурентному ингибированию

Blat Y. Non-competitive inhibition by active site binders. Chem Biol Drug Des. 2010 Jun;75(6):535-40.
McIlwain H. The origin and use of the terms competitive and non-competitive in interactions among chemical substances in biological systems. Essays Biochem. 1986;22:158-86.
Holmsen H, Storm E. The adenosine triphosphate inhibition of the pyruvate kinase reaction and its dependence on the total magnesium ion concentration. Biochem. J. 1969 Apr;112(3):303-16.
CRANE RK, SOLS A. The non-competitive inhibition of brain hexokinase by glucose-6-phosphate and related compounds. J. Biol. Chem. 1954 Oct;210(2):597-606.
Robinson PK. Enzymes: principles and biotechnological applications. Essays Biochem. 2015;59:1-41.
Hamad E, Babu K, Bebarta VS. Case Files of the University of Massachusetts Toxicology Fellowship: Does This Smoke Inhalation Victim Require Treatment with Cyanide Antidote? J Med Toxicol. 2016 Jun;12(2):192-8.
Suman SG, Gretarsdottir JM. Chemical and Clinical Aspects of Metal-Containing Antidotes for Poisoning by Cyanide. Met Ions Life Sci. 2019 Jan 14;19
Stratton A, Ericksen M, Harris TV, Symmonds N, Silverstein TP. Mercury(II) binds to both of chymotrypsin's histidines, causing inhibition followed by irreversible denaturation/aggregation. Protein Sci. 2017 Feb;26(2):292-305.
Wang B, Du Y. Cadmium and its neurotoxic effects. Oxid Med Cell Longev. 2013;2013:898034.
Sanchez OF, Lee J, Yu King Hing N, Kim SE, Freeman JL, Yuan C. Lead (Pb) exposure reduces global DNA methylation level by non-competitive inhibition and alteration of dnmt expression. Metallomics. 2017 Feb 22;9(2):149-160.
Bremer PT, Pellett S, Carolan JP, Tepp WH, Eubanks LM, Allen KN, Johnson EA, Janda KD. Metal Ions Effectively Ablate the Action of Botulinum Neurotoxin A. J. Am. Chem. Soc. 2017 May 31;139(21):7264-7272.
Ghadyale V, Takalikar S, Haldavnekar V, Arvindekar A. Effective Control of Postprandial Glucose Level through Inhibition of Intestinal Alpha Glucosidase by Cymbopogon martinii (Roxb.). Evid Based Complement Alternat Med. 2012;2012:372909.
Ratna Wulan D, Priyo Utomo E, Mahdi C. Antidiabetic Activity of Ruellia tuberosa L., Role of α-Amylase Inhibitor: In Silico, In Vitro, and In Vivo Approaches. Biochem Res Int. 2015;2015:349261.
Heng S, Harris KM, Kantrowitz ER. Designing inhibitors against fructose 1,6-bisphosphatase: exploring natural products for novel inhibitor scaffolds. Eur J Med Chem. 2010 Apr;45(4):1478-84.
Goto K, Kato N, Chung RT. Anti-hepatocellular carcinoma properties of the anti-alcoholism drug disulfiram discovered to enzymatically inhibit the AMPK-related kinase SNARK in vitro. Oncotarget. 2016 Nov 15;7(46):74987-74999.
Nims RW, Prough RA, Jones CR, Stockus DL, Dragnev KH, Thomas PE, Lubet RA. In vivo induction and in vitro inhibition of hepatic cytochrome P450 activity by the benzodiazepine anticonvulsants clonazepam and diazepam. Drug Metab. Dispos. 1997 Jun;25(6):750-6.
Chintakrindi AS, Martis EA, Gohil DJ, Kothari ST, Chowdhary AS, Coutinho EC, Kanyalkar MA. A Computational Model for Docking of Noncompetitive Neuraminidase Inhibitors and Probing their Binding Interactions with Neuraminidase of Influenza Virus H5N1. Curr Comput Aided Drug Des. 2016;12(4):272-281.

^Наверх